是一種在低溫條件下使組織快速冷卻到一定硬度，然后進行切片的方法。
因其制作過程較石蠟切片快捷、簡便，而多應用于手術中的快速病理診斷。
制備步驟:
將組織在恒溫冷凍機里面切片。
冷凍腔內的溫度一般設置為-18℃至-25℃，根據不同組織調節不同腔溫，平時應將冷凍頭放置在冷凍臺上。
冷凍切片機應長期處在冷凍恒溫狀態。
1、當冰凍組織提取好之后，在冷凍頭上放少量的OCT或羧田基纖維素(可用普通膠水代替)，放上組織，速凍。
2、待組織凍結后，將冷凍頭裝刀切片機上。
3、粗切，修出切面細切幾張，用毛筆刷去刀上組織片。
4、放下抗卷板，開始切片，切片速度一般為5-6微米，切出的片子用載玻片貼附后立即放入甲醇冰醋酸液(97ml甲醇+3ml冰醋酸)中固定，固定時間為10-20秒。
注意事項:
1、速凍是冰凍切片的關鍵，因為只有速凍才能減少組織內的冰晶，辦法就是將速凍頭迅速壓在組織上，切好后就可以凍片，特別適用于較脆的組織。
2、固定切片后應立即放入甲醇冰醋酸中固定，不能等切片干后再固定，后者容易造成細胞退變。固定液有很多種，甲醇作用快、收縮小、染色較清晰，是冰凍切片的固定液，而每97ml加入冰酸醋3ml，會減少某些膠質、鈣質較多的組織不容易掉片。
3、包埋劑可用普通膠水代替，但要加入適量的水(膠水與水的比例大約在2:1)。
太稀了容易損傷切片刀，太稠了黏在刀上不容易洗掉，影響切片的質量。
4、冰凍用切片刀不僅要磨得快，而且要磨得直，否則切出來的片子就會不平整，不能進入抗卷板(最好使用一次性刀片)。
5、如組織發脆，可以等幾分鐘后再切，也可用手在組織上稍微加溫;如果用手去摸組織塊，最好戴手套，或用玻片間的紙夾在手與組織之間，以防感染。
6、冷凍室的室溫冬天一般設置在-19℃左右，夏天設置在-22℃左右。
不同的組織有不同的溫度要求，如肝臟、甲狀腺組織溫度應設置在-15℃左右，脂肪組織一般設置在-35℃以下。
7、冷凍切片機應長期處于恒溫冷凍狀態，經常的開關電源容易造成設備損壞。
