ELISA技術要點與常見問題分析解答
ELISA技術要點與常見問題分析解答 上海聯碩生物科技有限公司 在ELISA實驗前的注意事項 1 仔細閱讀說明書 2 確定試劑盒在有效期內 3 按說明書確定所有試劑齊全（數量、體積） 4 標本制備要規范，每份標本體積要按2-3個復孔以上的量制備（貯存），盡量分裝做備份。短期內無法實驗者，注意低溫保存 5 準備好所有實驗額外所需物品，如試管、吸頭、移液器、離心機等 6 根據檢測標本數量確定所需試劑的量 7 按說明書將所用試劑平衡至室溫，配制所需試劑 DIY夾心法ELISA常見技術指南 8 選擇抗體時選擇一個單抗和一個多抗進行配對；若選擇兩個單抗，必須識別不同表位的抗體；從同一家公司選擇抗體對。 9 ELISA實驗中為了確定*信號和zui低背景應將捕獲抗體（0.5-4μg/ml）和檢測抗體（0.25-2μg/ml）在預實驗中進行彼此相抗的滴定。同時，應包括在適當范圍內的標準品的系列稀釋。按試劑說明書常規提供的范圍進行操作。 10 標準品的配制：對于每種細胞因子應仔細閱讀說明書，注意每批的細節。在使用細胞因子前，瞬時離心試劑瓶，盡可能多地收回其中的細胞因子。根據每批說明書中的細節，將凍干的細胞因子復溶。 11 一般待測抗原標準曲線的線性范圍的可通過將標準品做8次2倍系列稀釋從2000pg/ml 到15pg/ml。可利用標準的ELISA操作流程、放大試劑盒、第三類試劑、或改變酶底物系統可在一定范圍內提高靈敏度。 12 為了優化靈敏度，建議過夜孵育標準品和標本。 13 若使用過氧化物酶作為顯色系統，應嚴禁在洗液和稀釋液中加疊氮鈉，疊氮鈉可抑制過氧化物酶的活性。 14 當測定混合液體中的抗原時，如血清，建議在標本稀釋液中加不相干的Ig. ELISA常見問題及處理對策 問題 可能原因 解決方法 無顏色 試劑孵育的時間沒有按說明書操作。 確定生物素化抗體，連接的HRP試劑或鏈霉親和素-HRP使用的時間是否適當。 不同試劑盒或不同批號的試劑混用。 重新檢查試劑的標簽，確準所有組分都屬于正使用的試劑盒中的。不能混用不同試劑盒或不同批號的試劑。 漏加酶 檢查操作流程，注意不要漏加 HRP酶污染了疊氮鈉 使用新配制的試劑，禁含疊氮鈉 標準品有問題（若在標本孔中有信號） 按說明書檢查標準品的制備使用1瓶新標準品 某一容器未洗凈,殘留滅活酶物質 盡可能用試劑盒內容器,另覓一定要潔凈、可靠 使用含血清的緩沖液配制/復溶抗體 重新確認所選用的試劑 .漏加顯色劑A或B 加顯色劑后觀察一下液面高度 試劑配制/使用有誤 將實驗重做；嚴格按說明書操作，每次配制和使用前看清標簽。 緩沖液污染 配制新新鮮的緩沖液 顯色弱 超過有效期的產品可能會產生很弱的信號。 檢查產品的有效期 加入試劑的體積和時間有誤 確定所使用的每一個試劑的體積正確的和加入的時間是適當的。 試劑、樣品用前未能平衡 用前試劑、樣品置室溫平衡10分鐘左右 縮短孵育時間能使實驗的信號變弱。 檢查孵育的時間。 在溫度變化的環境內孵育酶標板。 確定孵育的溫度，應避免溫度的變化。 使用了被污染的試劑 檢查試劑是否被污染。 標準品/標本制備方法不規范 檢查標準品/標本的制備，標準品應按說明書進行復溶和稀釋。低溫貯存的標本避免反復凍融，嚴禁使用溶血標本。樣品用 NaN3防腐,抑制了酶的反應 顯色底物制備不規范 檢查底物的制備，如體積是否正確，混合是否恰當充分。 檢測時間不當 是否在規定的時間內檢測。 儀器設定不正確，濾光片不匹配。 儀器是否設定正確，濾光片的使用等。 高背景（本底） 洗滌操作不規范 洗板不充分，使用手工洗板常出現。使用洗板機，或使用洗瓶洗滌。每孔應*充滿洗滌緩沖液，傾出時應迅速。若使用洗板機，應校準并設定足夠充滿每孔的體積量。板的內側不應接觸設備。檢查每孔是否有殘留的洗液或每孔加樣量的體積是否準確。在兩次洗板之間加30秒的浸泡。 實驗中孵育溫度和時間不適當 確定每一實驗步驟的孵育溫度和時間是否適當 酶加量過多 加酶前驗看移液器調節量是否準確。檢查稀釋度，若必要進行效價測定。 封閉不* 檢查封閉液的計算量；提高封閉時間。 標本或標準品中的干擾物質 做適當的對照 顯色劑受光照時間較長,或污染 顯色劑A和B應于使用前10分鐘從冰箱取出 整批樣品放置時間過長,樣品污染 樣品應保持新鮮,或低溫保存,防止污染 緩沖液污染 制備新鮮的緩沖液 吸頭重復使用,未洗凈或消毒不*而用于加酶或顯色劑 吸頭盡可能一次性使用 太多的信號：全部的板子變成規則的藍色 不充分的洗滌/洗滌步驟被遺漏-沒結合的過氧化物酶仍有殘留。 使用洗板機充分洗滌檢查孔內是否有殘留的洗液或加樣量是否準確。 底物溶液混合太早并轉成藍色 應控制底物混合的時機并立即使用 太多的酶結合物 檢查稀釋度，必要時進行效價測定 封板膜或試劑容器被重復使用，導致HRP殘留，使TMB底物產生非特異藍色。 使用新鮮的封板膜，每步使用不同的試劑容器 緩沖液中污染金屬或HRP 制備新鮮緩沖液 高CV值（CV：coefficient of variation），花板 操作不慎或洗滌不充分 按說明書洗板、加樣、顯色。洗板尤為重要，如上所述 出現干板，沒有使用封板膜、封板膜重復使用 確定每兩步驟間，酶標板應保持濕潤。使用封板膜封口，注意每步使用新鮮的封板膜。 由于操作失誤或板子質量差（結合不均勻）造成包板不均勻。 稀釋用的PBS中不要加其它蛋白檢查包被和封閉液體積、時間和試劑加入的方法。 檢查所使用的酶標板，使用ELISA板子（不要使用組織培養板） 移液器不準確，吸頭重復使用。 檢查并校準移液器。每次取樣必須換吸頭。回顧標本的加入步驟，確保每次加樣的準確性，保證吸取的液體按所設定的體積吸入和排出，連續加樣時注意檢查吸頭，確保所加液體的體積。 樣品離心處理不全,反應孔內發生凝血或殘留細胞成分 標本充分離心, 3000rpm 6分以上，嚴禁使用凝血（溶血）的標本 緩沖液污染 制備新鮮的緩沖液 標準曲線可得到，但兩點之間區別很差（低或平的曲線） 酶結合物不足 檢查稀釋度，必要時進行效價測定 捕獲抗體沒有很好結合到板上 檢查所使用的酶標板，使用ELISA板子（不要使用組織培養板）稀釋用的PBS中不要加其它蛋白 檢測抗體不足 檢查稀釋度，必要時進行效價測定 板子顯色不足 延長底物孵育實驗使用推薦品牌的底物溶液 操作不慎 回顧ELISA操作流程，消除任何擅自修改的程序。 標準曲線稀釋度計算有誤 核查計算的情況，制備新的標準曲線 標準曲線很好，但是沒有任何期望的陽性信號產生 在標本中無相應的細胞因子 使用內參對照重復實驗，重新考慮實驗的相應參數 標本基質遮蓋檢測 將標本至少做1∶2相應的稀釋，或進行系列稀釋觀測它的恢復性 標準曲線很好，但是標本的判讀值很高 標本中含的細胞因子水平超過實驗范圍 將標本做稀釋并再次實驗 當使用HRP酶結合物時，TMB底物加終止液后顯綠色 孔中的試劑顯色不充分 輕輕振蕩板子 邊緣效應 工作環境溫度不均衡 避免將板子在變化溫度環境中孵育 漂移 實驗過程中出現間斷 整個實驗應連續操作：在實驗開始前將所有標準品和標本做適當的準備 試劑沒有按說明書平衡至室溫 在所有試劑加入孔前，確保它們已平衡至室溫，除非說明書中有另外的要求。 是否可更改試劑盒 所提供的實驗操作步驟？ 一般廠商為確保zui高的靈敏度和特異性，對試劑盒都進行了優化，為確保每一試劑盒實驗的規范性應按說明書操作。 是否可混用不同試劑盒中的試劑？ 不行。絕大多數試劑在每批試劑盒中是特異的，若有問題可與廠家或代理商。 是否可增加或減少標本的體積。 商品化的試劑盒所需加入的標本體積是優化的，應按說明書操作，不建議更改所加標本的體積。 是否可重確定自己的標準曲線的點？ 可以。說明書上有建議的制備標準曲線時標準品的稀釋度，可改變稀釋倍數和增加曲線的點，但是必須在實驗范圍內，高于試劑盒中zui高標準品的點和低于靈敏度以下的點是無效的。
